胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (34): 5515-5519.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.018

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胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收

迟妍妍^1，2，乐尧金^1，2，刘旭昭²，李琪²，雷静^1，3，汤顺清³

¹广东省医用胶原工程技术研究开发中心，广东省广州市 510663；²广州创尔生物技术股份有限公司，广东省广州市 510250；³暨南大学生物医学工程研究所，广东省广州市 510632

修回日期:2014-06-23 出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-20
作者简介:迟妍妍，女，1986年生，浙江省温州市人，汉族，2011年上海海洋大学毕业，硕士，主要从事分子生物学研究。并列第一作者：乐尧金，男，1987年生，江西省九江市人，汉族，2012年暨南大学毕业，硕士，初级工程师，主要从事功能蛋白研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2012B070800007)；广州经济技术开发区科技项目(2014S-P010)；广州市科技计划项目(2014JR000021)；广东省海洋经济创新发展区域示范专项(GD2012-B03-002)

Biological properties, degradation and absorption of collagen sponges in vivo

Chi Yan-yan^{1, 2}, Le Yao-jin^{1, 2}, Liu Xu-zhao², Li Qi², Lei Jing^{1, 3}, Tang Shun-qing³

¹Guangdong Medical Collagen Engineering and Technology Research Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; ²Guangzhou Trauer Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510250, Guangdong Province, China; ³Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Revised:2014-06-23 Online:2014-08-20 Published:2014-08-20
About author:Chi Yan-yan, Master, Guangdong Medical Collagen Engineering and Technology Research Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; Guangzhou Trauer Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510250, Guangdong Province, China Le Yao-jin, Master, Engineer, Guangdong Medical Collagen Engineering and Technology Research Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; Guangzhou Trauer Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510250, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan of Guangdong Province, No. 2012B070800007; the Scientific Project of the Development Zone of Guangzhou Gity, No. 2014S-P010; the Science and Technology Plan of Guangzhou City, No. 2014JR000021; the Special Fund for the Innovative and Developmental Region of Marine Economy in Guangdong Province, No. GD2012-B03-002

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原蛋白海绵适用于各种损伤创面的止血修复及残腔填充，具有广泛的临床应用和科学研究价值。

目的：研究胶原蛋白海绵的生物特性及其在动物体内的生物相容性和降解情况。

方法：通过扫描电镜测定胶原蛋白海绵的空间结构、孔径和孔隙率，透射电镜观察其构象，圆二色谱法分析其二级结构及变性温度。在新西兰白兔脊柱侧肌肉内植入胶原蛋白海绵，组织病理切片观察海绵降解吸收情况。

结果与结论：胶原蛋白海绵具有疏松多孔结构，孔径分布为40-150 μm，平均100 μm，孔壁1 μm左右，孔隙率约95.8%，具有典型的多孔材料结构，胶原具有周期性横纹区带。胶原蛋白溶液在220，206 nm处分别有一正、负峰，具有典型的胶原蛋白三螺旋结构特征；胶原蛋白海绵与胶原溶液具有相似的二级结构及热稳定性。胶原蛋白海绵植入肌肉第4周开始降解，至第12周胶原蛋白海绵可见率为20%左右；植入2周后胶原蛋白海绵周围局部组织出现异物刺激及炎症反应，随创面愈合，炎症反应逐渐减轻并消失，在整个材料植入和降解周期内无明显纤维囊结构形成，植入部位未见组织坏死情况发生。表明胶原蛋白海绵具有良好的生物活性、生物相容性及降解性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原蛋白, 胶原蛋白海绵, 体内降解, 生物相容性, 圆二色谱, 扫描电镜

Abstract:

BACKGROUND: Collagen sponges are applied for hemostatic use, wound healing, and residual cavity filling, which have great values in clinical application and scientific research.

OBJECTIVE: To investigate the biological properties, biocompatibility and biodegradability of collagen sponges in vivo.

METHODS: The spatial structure, pore diameter and porosity of collagen sponges were characterized by scanning electron microscopy. Transmission electron microscopy was used to observe the conformation of collagen sponges. The secondary structure and thermal denaturation temperature of collagen sponges were analyzed by circular dichroism spectrum. Collagen sponges were implanted intramuscularly into the spinal cord of New Zealand rabbits to observe the degradation and absorption and histological changes in vivo.

RESULTS AND CONCLUSION: Collagen sponges had porous structure with varying pore sizes ranging 40-150 μm, the mean pore size of 100 μm, the thickness wall of 1 μm, and a porosity of approximately 95.8%. Collagen sponges had a typical porous structure and periodic light and dark zones. The solution of collagen sponges had a weak positive band near 220 nm and an intense negative band near 206 nm, which indicated a classic triple helix. And the secondary structure and thermal stability of collagen sponges were similar to that of liquid collagen. Collagen sponges began to degrade at 4 weeks, and remained 20% at 12 weeks. These sponges had been associated with foreign body response and inflammation within 2 weeks after implantation. With wound healing, inflammatory reactions gradually reduced and disappeared. During the implantation and degradation of sponges, no significant fibrous capsule formed and no tissue necrosis occurred at implantation site, indicating that collagen sponges have good performance in bioactivity, biocompatibility and degradation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: collagen, egg white, materials testing

中图分类号:

R318

迟妍妍，乐尧金，刘旭昭，李琪，雷静，汤顺清. 胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(34): 5515-5519.

Chi Yan-yan, Le Yao-jin, Liu Xu-zhao, Li Qi, Lei Jing, Tang Shun-qing. Biological properties, degradation and absorption of collagen sponges in vivo[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(34): 5515-5519.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 24只新西兰兔均进入结果分析。

2.2 胶原蛋白海绵的电镜分析 扫描电镜分析经测定胶原蛋白海绵孔径分布为40-150 μm，平均100 μm，孔壁 1 μm左右，孔隙率约95.8%，呈纤维细丝网状结构，见图1A。图1B显示的是胶原蛋白海绵的透射电镜图，胶原纤维呈现分散态，纤维直径200-300 nm，可观察到胶原具有的特殊的周期性横纹区带。

2.3 胶原蛋白海绵的圆二色谱分析 胶原由3条α肽链组成，α肽链自身为α螺旋结构，3条α肽链则以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构。采用圆二色谱法测定胶原溶液、胶原蛋白海绵二级结构特征，结果显示两者图谱具有非常好的重叠性(图1C)，均在220 nm有一强的正特征吸收峰，206 nm左右有一强负特征吸收峰，具有典型胶原蛋白三螺旋结构的特征吸收性质，说明在胶原溶液冻干成海绵过程中胶原构象并未发生变化。

对圆二色谱所测数据采用Cdpro软件分析胶原蛋白海绵中不同二级结构所占的比例，其中α螺旋含量为34.4%，β折叠为33%，β转角为16.8%，无规卷曲为16.4%。与对照组胶原溶液一致。

圆二色谱同时可以反映胶原溶液与胶原蛋白海绵的变性温度，当胶原蛋白的三螺旋结构被完全破坏时，正峰会完全消失。如图2所示，以220 nm处吸收峰的变化为例说明，纵坐标反映二级结构α螺旋构象的变化情况，显示胶原溶液在33 ℃之后正吸收峰值开始降低，构象遭到破坏，随着温度进一步升高，当温度达到50 ℃左右，蛋白变性达到最大程度；胶原蛋白海绵在30 ℃左右正吸收峰值开始降低，随着温度升高到达48 ℃构象完全遭到破坏，二者变性温度基本一致。

2.4 胶原蛋白海绵动物体内降解吸收的组织病理观察 实验组术后2周伤口痊愈，未出现出血、红肿、坏死和试样排出等异常现象，海绵的降解率为0。术后第2，4，8，12周取材，第4周可见到胶原蛋白海绵，海绵的降解率为0，第8周海绵的降解率为33%，至12周海绵降解率达75%(图3)。

病理组织切片分析显示，第2周植入部位有明显异物反应，可见较多单核细胞及少量异物巨细胞浸润，组织炎症反应小于Ⅲ级(图4A)；第4周植入部位可见较多增生结缔组织，其中散在单核细胞浸润，未见异物巨细胞，炎症反应小于Ⅰ级，且未见明显纤维囊结构(图4B)；术后第8周，植入部位可见较多纤维结缔组织增生并发生玻璃样变，散在单核细胞浸润，未见异物巨细胞(图4C)；随着植入时间达12周，植入部位未见单核细胞、淋巴细胞及异物巨细胞浸润，炎症反应逐渐消失，可见脂肪细胞，且有结缔组织增生(图4D)。空白对照组在实验过程中均未出现异物反应(图4E)。

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引言

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，相对分子质量约为300 000，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%-30%^[1]。胶原作为一种纤维状蛋白，自身即为优良的组织工程支架材料，是最早被利用的生物材料之一^[2]，拥有特殊的三股肽链螺旋结构，具有可降解性、生物相容性和止血性等许多优良的生物学特性，近些年在创面修复领域得到了广泛应用，并形成多种产品形式。其中胶原蛋白海绵是由胶原溶液经冻干形成，是基于胶原生物材料的一种主要产品形式，已被广泛应用于各种创面止血^[3]，组织残腔的填充修复^[4]。张安美^[5]将凝血酶与胶原蛋白海绵联合用于手术创面，发现其有较好的止血作用和安全性。另外，也有很多报道将人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮等制备的胶原蛋白海绵用于临床治疗^[6-11]，其良好的功能和特性，以及易于加工、灭菌和保存等独特优势，被视为非常有前景的生物材料之一，具有广泛的科研和临床应用价值^[12-14]。

张立彦等^[15]通过考察形貌及理化特征优化了壳聚糖/胶原蛋白复合海绵性能，使其抗张强度为85 MPa、断裂伸长率为4.87%、吸水率为200%、孔隙率为78.8%，采用扫描电镜检测复合海绵孔径大小为100-150 μm。王秋卓^[16]以牛跟腱为原材料，分析了海绵状胶原蛋白纤维均匀度、抗原性、色泽及纤维细度等性状，并观察了产品的纯度和胶原纤维结构。汪海婴等^[17]采用差式扫描量热仪、体外模拟胶原蛋白酶降解、材料拉伸性能分析及NIH/3T3细胞培养实验评价了鱼皮酸溶性胶原海绵，鱼皮酶溶性胶原海绵和猪皮酶溶性胶原海绵的材料热稳定性、降解性、生物相容性和材料机械力学性能。

对生物材料相容性研究有很多方法，其中常用的有体内直接植入法和体外复合细胞培养法两种。马忠仁等^[18]将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾成纤维细胞共培养，发现海绵具有良好的生物相容性。方成等^[19]将鱼皮酸溶性胶原蛋白、鱼皮酶溶性胶原蛋白、猪皮酶溶性胶原蛋白植入SD大鼠，评价细胞附着、免疫原性及致炎性等，结果表明鱼皮酶溶性胶原海绵具有组织相容性优势。Ueda等^[20]利用胶原海绵结合转化生长因子β1植入促进兔颅骨缺损骨修复，结果显示海绵表现出良好的生物相容性和促修复作用。

本实验选择牛源胶原蛋白海绵为研究对象，评价其微观结构、变性温度、降解性能、生物相容性等生物性能，评估牛源活性胶原蛋白海绵在生物医学领域的应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：材料特性及动物实验观察。

时间及地点：实验于2012年4至7月在暨南大学和广州中医药大学实验动物中心完成。

材料：

实验动物：11至12周龄普通级新西兰兔24只，雌雄不拘，体质量1.8-2.2 kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：0104935，动物实验环境设施合格证号：0062307。

药物及试剂：胶原蛋白海绵(广州创尔生物技术股份有限公司，批号20110404)；水合氯醛(上海化学试剂采购供应五联化工厂，批号：20050620)；安尔碘(上海利康消毒高科技有限公司，批号：20120216)。

实验方法：

胶原蛋白海绵的形貌与热稳定性研究：

扫描电镜分析胶原蛋白海绵的形貌：通过扫描电镜观察胶原蛋白海绵的孔径及纤维结构。用D-Hank’s液小心洗涤样品，以2%戊二醛和1%锇酸4 ℃固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，扫描电镜观察^[21]。

透射电镜分析胶原的微观结构：取一定量的胶原蛋白海绵，溶于0.1 mol/L醋酸溶液，配制成胶原溶液，取少许胶原溶液，采用负染法制备电镜样品，pH 7.4条件下的1%磷钨酸染色1 min，自然风干，于Philips Tecnai 10透射电镜下观察其形态。

圆二色谱分析胶原的二级结构及热稳定性：准确称取一定量胶原蛋白海绵，溶于0.1 mol/L醋酸溶液，配制成质量浓度为0.5 g/L的蛋白溶液。将溶液样品加入1 mm光径的石英池，在180-260 nm波长范围内进行扫描，记录结果为3次扫描的平均值。以冻干成海绵前的胶原溶液作为对照组。

变温扫描选取[θ]_{220 nm}处进行，取胶原溶液、胶原蛋白海绵配置的蛋白溶液样品分别加入1 mm光径的石英池，温度区间设置为15-60 ℃，升温速率为1 ℃/min^[17]。

植入后材料的降解、吸收及组织相容性研究：

动物模型建立：将所选兔随机均分为两组，其中实验组兔在脊柱两侧约2 cm处等距离各选2个植入点，每点间隔2 cm，左右两侧各2个点植入胶原蛋白海绵。手术切开皮肤，分离皮下组织和筋膜，以止血钳分离植入点肌肉，将胶原蛋白海绵植入深度为1.0-2.0 cm的肌肉内，缝合肌肉及皮肤；空白对照组手术切开皮肤，分离皮下组织和筋膜，以止血钳分离植入点肌肉，然后缝合肌肉及皮肤。实验后连续3 d每只注射20×10⁴ U/d的青霉素，以防感染。术后观察创面愈合情况，术后2，4，8，12周每次取材3只。

胶原蛋白海绵动物体内降解、吸收的组织病理观察：所有兔单笼喂养，术后观察记录伤口愈合情况。分别于术后2，4，8，12周处死新西兰兔，取出脊柱两侧肌肉，观察海绵植入后不同时期的降解率。取包裹试样周围0.5-1.0 cm的肌肉组织，体积分数10%甲醛固定，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察炎症反应(分级)、细胞种类数量特征、包囊形成情况。

主要观察指标：胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收。

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讨论

在形貌特征方面，作为组织工程使用的支架，胶原蛋白海绵其疏松多孔结构有利于细胞黏附^[22]，本实验制备的海绵具有疏松多孔结构，孔径平均为100 μm，孔隙率约95.8%，多孔结构均一、致密。与文献报道的优化海绵的孔径基本一致^[15]，但孔隙率占优势。胶原蛋白的生物活性依赖于其三级结构的完整性^[23]，本实验通过电镜观察和圆二色谱分析其三级结构，验证胶原蛋白海绵的生物活性。与大量文献报道一致^[24]，电镜下观察到胶原具有的特殊的周期性横纹区带。

圆二色谱是测定溶液中蛋白质二级结构的一种快速、简单方法，还可以用于研究蛋白质受温度影响时构象的变化情况。本实验通过将胶原蛋白海绵溶解获得的胶原蛋白溶液进行圆二色谱分析，发现在220 nm附近出现正峰， 202 nm左右出现负峰。与大量文献报道的具有三螺旋结构的活性胶原蛋白圆二色特征吸收峰相一致^[25-26]，说明胶原蛋白经冻干工艺形成海绵的过程中，其二三级结构仍保持完整，具有良好的生物活性。热变性温度是反映胶原蛋白天然螺旋结构完整性的一项重要指标，当体系温度达到变性温度Td时，胶原分子从伸展的纤维状转变为无规则卷曲状。差示量热扫描分析及圆二色谱分析是研究热变性温度的常见方法^[27]。有研究表明利用圆二色谱分析正峰强度的变化，在一定程度上能够反映胶原蛋白结构的变化，当胶原蛋白的三螺旋结构被完全破坏时，220 nm的正峰会完全消失^[28-30]。本实验通过圆二色谱分析胶原溶液220 nm的正峰变化，当温度升至35 ℃以上，胶原的圆二色性发生强烈改变，正峰强度急剧减小，胶原蛋白三股螺旋立体结构被破坏，胶原蛋白发生变性，与文献报道差示量热扫描分析测定的牛源、鱼源胶原蛋白变性温度基本一致^{[17, 31]}。

胶原蛋白海绵属于天然可降解生物活性材料。本实验通过体内埋植实验验证胶原蛋白海绵生物相容性，植入初期在植入部位有少量炎性细胞聚集，局部组织出现异物反应，这属于机体对异物的正常反应；随着创面的愈合，植入部位的炎性细胞逐渐减少，周围结缔组织增生明显，炎症反应逐渐消失。组织病理学检查发现，肌肉植入第4-8周降解比较显著，到第12周材料可见率低于25%，在整个材料植入和降解周期内无明显纤维囊结构形成，植入部位未见组织坏死情况发生，植入机体后除轻微和短时的炎症反应外，未发生严重不良反应，材料与组织的生物相容性良好。这与Anselme等^[24]将胶原海绵皮下植入的组织反应、超微结构、免疫学研究、降解周期(3个月)相一致。

基于胶原蛋白海绵良好的生物相容性和可降解性，大量研究及应用以胶原基生物材料，结合细胞种植或添加其他活性物质如庆大霉素、生长因子等^[32-34]，进一步拓展了其应用范围，因此胶原蛋白海绵将在生物材料领域发挥其重要的潜在价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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胶原蛋白海绵的生物特性及体内降解吸收

Biological properties, degradation and absorption of collagen sponges in vivo

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